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    密理博ECL发光液的使用方法和注意事项

    DIANJICISHU:35 FABUSHIJIAN:2019-12-13

       密理博ECL发光液是基于鲁米诺的新一代增强型化学发光底物试剂,可与二抗上偶联的辣根过氧化物酶催化产生化学反应从而发出荧光,结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现或使用化学发光成像仪检测。
     
      密理博ECL发光液的使用方法:
      1.使用合适的方法进行Western,直至用PBST洗涤二抗。
     
      2.新鲜配制ECL工作液:试剂I和试剂II按1:1混合后,用双蒸水10倍稀释,混合后即为ECL工作液。须立即使用。
     
      3.印迹膜蛋白面朝上,用ECL工作液均匀滴加至印迹膜室温孵育1-2分钟。ECL工作液使用量大约为0.125ml/cm2膜或根据个人实验习惯使用。
     
      4.用平头镊夹住印迹膜,垂直置于吸水纸以吸去多余工作液。
     
      5.快速将印迹膜置于二层保鲜膜之间,尽量赶尽气泡。
     
      6.将印迹膜蛋白面朝上,放于X光胶片暗盒内。
     
      7.在暗室内放入X光片,曝光,显影。
     
      密理博ECL发光液的注意事项:
      (1)可在日光灯下操作;但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
     
      (2)长时间曝光或蛋白过量,将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。
     
      (3)发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见,低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光,因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳,可用洗膜缓冲液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL发光和曝光。
     
      (4)由于密理博ECL发光液极其灵敏,强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗1:1000~1:4000,二抗1:2000~1:5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带,导致失败。
     
      (5)某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光,应选择高质量保鲜膜。
     
      (6)使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。
     
      (7)NaN3能抑制HRP活性,回收第二抗体应避免使用NaN3,如必需使用勿超过0.01%。

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